西美濃から近江方面へ進軍する際の重要な拠点となり、賤ヶ岳の戦いでは兄・秀吉の「中国大返し」に通じる“美濃大返し”の舞台として歴史に刻まれました。小牧・長久手の戦いにおいても秀吉が滞在したとされ、戦いの後に自身の家臣を城主として在任させ、大垣城を重要視していたことが窺える書状を送っています。そして弟・秀長もわずかな期間、城主を務めたとされます。
また、秀吉の死去にはじまる徳川家康と石田三成の争いの中で、西軍の三成は、関ケ原合戦の直前、大垣城に入城して西軍の本営となりました。